激光共聚焦顯微鏡屬于納米級測量儀器，因此在納米觀測領域常用激光共聚焦顯微鏡。為增進大家對激光共聚焦顯微鏡的認識，本文將對激光共聚焦顯微鏡原理以及激光共聚焦顯微鏡的功能予以介紹。如果你對激光共聚焦顯微鏡具有興趣，不妨繼續(xù)往下閱讀哦。

一、激光共聚焦顯微鏡原理

在普通寬視野光學顯微鏡中，整個標本全部都被水銀弧光燈或氙燈的光線照明，圖像可以用肉眼直接觀察。 同時，來自焦點以外的其他區(qū)域的熒光對結構的干擾較大，尤其是標本的厚度在 2um 以上時，其影響更為明顯。

激光共聚焦顯微鏡脫離了傳統光學顯微鏡的場光源和局部平面成像模式，采用激光束作光源，激光束經照明針孔，經由分光鏡反射至物鏡，并聚焦于樣品上，對標本焦平面上每一點進行掃描。 組織樣品中如果有可被激發(fā)的熒光物質，受到激發(fā)后發(fā)出的熒光經原來入射光路直接反向回到分光鏡，通過探測針孔時先聚焦，聚焦后的光被光電倍增管(PMT)探測收集，并將信號輸送到計算機，處理后在計算機顯示器上顯示圖像。 在這個光路中，只有在焦平面的光才能穿過探測針孔，焦平面以外區(qū)域射來的光線在探測小孔平面是離焦的，不能通過小孔。因此，非觀察點的背景呈黑色，反差增加，成像清晰。由于照明針孔與探測針孔相對于物鏡焦平面是共軛的，焦平面上的點同時聚焦于照明針孔與探測針孔，焦平面以外的點不會在探測針孔處成像，即共聚焦。 以激光作光源并對樣品進行掃描，在此過程中兩次聚焦，故稱為激光掃描共聚焦顯微鏡。

二、激光共聚焦顯微鏡功能

1、組織和細胞中的定量熒光測定

激光掃描共聚焦顯微鏡可以從固定和熒光染色的標本以單波長、雙波長或多波長模式，對單標記或多標記的細胞及組織標本的共聚焦熒光進行數據采集和定量分析,同時還可以利用沿縱軸上移動標本進行多個光學切片的疊加， 形成組織或細胞中熒光標記結構的總體圖像,以顯示熒光在形態(tài)結構上的精確定位。 常用于原位分子雜交、腫瘤細胞凋亡觀察、單個活細胞水平的 DNA 損傷及修復等定量分析。

2、細胞間通訊的研究

動物和植物細胞中縫隙連接介導的胞間通信在細胞增殖和分化中起著重要作用。 激光掃描共聚焦顯微鏡可通過觀察細胞縫隙連接分子的轉移來測量傳遞細胞調控信息的一些離子、小分子物質。 該技術可以用于研究胚胎發(fā)生、生殖發(fā)育、神經生物學、腫瘤發(fā)生等過程中縫隙連接通訊的基本機制和作用，也可用于鑒別對縫隙連接作用有潛在毒性的化學物質。

3、細胞物理化學測定

激光掃描共聚焦顯微鏡可對細胞形狀、周長、面積、平均熒光強度及細胞內顆粒數等參數進行自動測定。 能對細胞的溶酶體、線粒體、內質網、細胞骨架、結構性蛋白質、DNA、RNA、酶和受體分子等細胞內特異結構的含量、組分及分布進行定量、定性、定時及定位測定。

4、細胞內鈣離子和 pH 值動態(tài)分析

激光掃描共聚焦顯微鏡技術是測量若干種離子濃度并顯示其分布的有效工具，對焦點信息的有效辨別使在亞細胞水平顯示離子分布成為可能。 利用熒光探針，激光掃描共聚焦顯微鏡可以測量單個細胞內 pH 和多種離子(Ca2+、K+、Na+、Mg2+)在活細胞內的濃度及變化。 一般來說，電生理記錄裝置加攝像技術檢測細胞內離子量變化的速度相對較快,但其圖像本身的價值較低,而激光掃描共聚焦顯微鏡可以提供更好的亞細胞結構中鈣離子濃度動態(tài)變化的圖像,這對于研究鈣等離子細胞內動力學有意義。

5、三維圖像的重建

傳統的顯微鏡只能形成二維圖像，激光掃描共聚焦顯微鏡通過對同一樣品不同層面的實時掃描成像，進行圖像疊加可構成樣品的三維結構圖像。 它的優(yōu)點是可以對樣品的立體結構分析，能十分靈活、直觀地進行形態(tài)學觀察,并揭示亞細胞結構的空間關系。

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